Next-generation sequencing (mutatie- en fusieanalyse) FFPE

Doel
Next-generation sequencing (NGS) na AmpliSeq aanrijking voor de detectie van mutaties, kleine inserties en deleties, amplificaties en fusies in meerdere genen.

Toepassingsgebied
Detectie van diagnostische, prognostische en predictieve genveranderingen in solide tumoren.

Principe
Deze test bestaat uit verschillende onderdelen.
(1) Na macrodissectie van het tumormateriaal wordt TNA (=genomisch DNA plus RNA) geïsoleerd uit formaline-gefixeerd en paraffine-ingebed (FFPE) tumorweefsel.
(2a) Voor DNA mutatieanalyse worden de genen van interesse verrijkt met behulp van de AmpliSeq methode. (Zie ' panels' voor de genen die gedetecteerd kunnen worden).
(2b) Voor fusiegenanalyse worden de fusiegentranscripten geconverteerd naar cDNA en verrijkt met behulp van de AmpliSeq methode. (Zie ' panels' voor de fusiegentranscripten die gedetecteerd kunnen worden). 
(3) Data analyse wordt uitgevoerd met de Ion Reporter en IGV software.

Panels 
Voor volledige beschrijving van de genen en genregio's zie Overzicht onderzochte genen en fusies Ampliseq

• Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC (Oncomine Focus Assay, OFA)
  DNA mutatieanalyse (Oncomine Focus Assay, OFA)
  AKT1, ALK, AR, BRAF, CDK4, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, GNAQ, HRAS, IDH1, IDH2, JAK1, JAK2, JAK3, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, RAF1, RET, ROS1 en SMO.
  De detectielimiet van deze assay werd vastgelegd op een variant allel-frequentie (VAF) van ≥ 5%
  Fusiegentranscripten (RNA, OFA panel)
  ALK, RET, ROS1, NTRK 1/2/3, FGFR 1/2/3, MET, BRAF, RAF1, ERG, ETV1, ETV4, ETV5, ABL1, AKT3, AXL, EGFR, ERBB2, PDGFRA en PPARG.
  Let op: deze test is niet fusiepartner agnostisch. Zie Overzicht onderzochte genen en fusies Ampliseq voor fusiegentranscripten die gedetecteerd kunnen worden.
   

• Colorectale tumoren (Oncomine Focus Assay, OFA)
  AKT1, ALK, AR, BRAF, CDK4, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, GNAQ, HRAS, IDH1, IDH2, JAK1, JAK2, JAK3, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, RAF1, RET, ROS1 en SMO.
  De detectielimiet van deze assay werd vastgelegd op een variant allel-frequentie (VAF) van ≥ 5%.
   
• Melanomen en GIST (Oncomine Focus Assay, OFA, aangevuld met Oncomine Solid Tumor, OST)
  OFA panel: AKT1, ALK, AR, BRAF, CDK4, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, GNAQ, HRAS, IDH1, IDH2, JAK1, JAK2, JAK3, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, RAF1, RET, ROS1 en SMO.
  OST panel: POLE, STK11 en TERT promotor regio, en bijkomende regio's in EGFR, ERBB4, FGFR2, KIT, MET en ROS1. 
  De detectielimiet van deze assay werd vastgelegd op een variant allel-frequentie (VAF) van ≥ 5%.
   
• Endometrium tumoren (Custom panel aangevuld met Oncomine Solid Tumor, OST)
  AKT1, ATM, ATR, CDK12, CHEK2, DICER1, ERBB2, ESR1, FOXL2, MLH1, MSH2, MSH6, PALB2, PIK3CA, PMS2, POLE, PPP2R1A, RAD51B, RAD51C, RAD51D, TP53, en TP53BP1.
  OST panel: POLE, STK11 en TERT promotor regio, en bijkomende regio's in EGFR, ERBB4, FGFR2, KIT, MET en ROS1. 
  De detectielimiet van deze assay werd vastgelegd op een variant allel-frequentie (VAF) van ≥ 6%.
   
• Gynaecologische tumoren muv endometrium (Custom panel)
  AKT1, ATM, ATR, CDK12, CHEK2, DICER1, ERBB2, ESR1, FOXL2, MLH1, MSH2, MSH6, PALB2, PIK3CA, PMS2, POLE, PPP2R1A, RAD51B, RAD51C, RAD51D, TP53, en TP53BP1.
  De detectielimiet van deze assay werd vastgelegd op een variant allel-frequentie (VAF) van ≥ 6%.
   
• Gliomen (Custom panel)
  ACVR1, ATRX, BRAF, CDK6, CDKN2A, CIC, DAXX, EGFR, FUBP1, H3F3A, H3F3B, HIST1H3B, HIST1H3C, IDH1, IDH2, MET, NF1, PIK3CA, PDGFRA, PTEN, TERT promotor, TP53.
  De detectielimiet van deze assay werd vastgelegd op een variant allel-frequentie (VAF) van ≥ 6%. 
  Met dit panel kunnen eveneens EGFR amplificatie en chr. 1p/19q co-deletie bepaald worden wanneer het staal >25% neoplastische cellen bevat.
   
• Schildkliertumoren (Custom panel) 
  AKT1, BRAF, CTNNB1, EGFR, EIF1AX, GNAS, HRAS, KRAS, NRAS, PIK3CA, PTEN, RET, TERT promotor, TP53 en TSHR. 
  De detectielimiet van deze assay werd vastgelegd op een variant allel-frequentie (VAF) van ≥ 5%.
  Indien geen mutatie wordt aangetoond volgt een RNA fusiegen analyse. 
  Fusiegentranscripten (RNA, OFA panel)
  ALK, RET, ROS1, NTRK 1/2/3, FGFR 1/2/3, MET, BRAF, RAF1, ERG, ETV1, ETV4, ETV5, ABL1, AKT3, AXL, EGFR, ERBB2, PDGFRA en PPARG.
  Let op: deze test is niet fusiepartner agnostisch. Zie Overzicht onderzochte genen en fusies Ampliseq voor fusiegentranscripten die gedetecteerd kunnen worden.
   
• Pancreastumoren (Custom panel) 
  AKT1, BRAF, CTNNB1, EGFR, EIF1AX, GNAS, HRAS, KRAS, NRAS, PIK3CA, PTEN, RET, TERT promotor, TP53 en TSHR. 
  De detectielimiet van deze assay werd vastgelegd op een variant allel-frequentie (VAF) van ≥ 5%.
   
• Tumortype agnostisch fusiegentranscript analyse (RNA, OFA panel)
  Bij verdenking van een fusiegen (bijv. NTRK obv TRK expressie in IHC) wordt een RNA fusiegen analyse ingezet.
  ALK, RET, ROS1, NTRK 1/2/3, FGFR 1/2/3, MET, BRAF, RAF1, ERG, ETV1, ETV4, ETV5, ABL1, AKT3, AXL, EGFR, ERBB2, PDGFRA en PPARG.
  Let op: deze test is niet fusiepartner agnostisch. Zie Overzicht onderzochte genen en fusies Ampliseq voor fusiegentranscripten die gedetecteerd kunnen worden.

Rapportering
Voor de duiding van de relevantie van de variant op de functie van het eiwit wordt gebruik gemaakt van de ACMG standards (Richards et al., 2015; Plon et al., 2008) waarbij onderscheid wordt gemaakt in 5  klasses:
Klasse 5: Pathogeen
Klasse 4: Vermoedelijk pathogeen
Klasse 3: Ongekende significantie (variant of unknown significance, VUS)
Klasse 2: Vermoedelijk benigne
Klasse 1: Benigne
Enkel de klassen 3, 4 en 5 worden gerapporteerd. Klinisch advies wordt enkel bij klasse 4 en 5 varianten gegeven. 
Zie Hébrant et al.: The Belgian next generation sequencing guidelines for haematological and solid tumours. Belg.J.Med.Oncology. 2017.

Pre-analytische eissen die aan het weefsel gesteld worden
Fixatie van weefsel in 10% gebufferde formol (4% formaldehyde, NF4) voor een duur van 6 tot 72 uur. Overfixatie resulteert in fixatieartefacten en een niet-interpreteerbaar NGS resultaat.
Percentage neoplastische cellen ten opzichte van het totaal aantal cellen in het weefsel bepaalt mede de detectie limiet en dient meer dan 10% te zijn. Indien lager dan wordt het resultaat onder voorbehoud gerapporteerd en kan een vals-negatieve uitslag niet uitgesloten worden.
Het minimale tumoroppervlak zichtbaar in de HE-kleuring dat nodig is voor TNA extractie is  > 5 mm², behalve voor de analyse gynaecologische tumoren en gliomen waarvoor >10 mm² nodig is.
Indien meerdere paraffineblokken van de tumor voorhanden zijn, selecteer het blok waarin zones met het hoogste percentage neoplastische cellen aanwezig zijn en dat voldoet aan de criteria voor het tumoroppervlak voor een betrouwbaar NGS resultaat.

Aanrekening
Uitgevoerde analyses die niet betaald worden via RIZIV (KB art.33bis, ter of NGS conventie), worden in principe aangerekend aan de patiënt. Voor meer informatie, gelieve u te wenden tot MOLD@uza.be

Accreditatie
De dienst Pathologische Anatomie van het Universitair Ziekenhuis Antwerpen is ISO15189 geaccrediteerd voor deze analyse (BELAC certificaatnummer 367-MED).​