MLH1 Hypermethylatie

Doel: MLH1 methylatie analyse wordt aangevraagd om hypermethylatie van de promoter regio van MLH1 op te sporen.

Principe: De test bestaat uit verschillende onderdelen. (1) Genomisch DNA wordt geïsoleerd uit het tumorweefsel. (2) Bisulfide conversie waarbij ongemethyleerde C nucleotides worden omgezet naar T nucleotides (3) Methylatie specifiek PCR waarbij enkel gehypermethyleerde promoter regio van MLH1 wordt geamplificeerd. In dezelfde reactie wordt eveneens een controlegen (ACTB) geamplificeerd om de kwaliteit van het template te evalueren.

Technische opmerking: Het percentage tumorcellen aanwezig in de paraffinecoupe bepaalt mede de detectielimiet van deze test. Paraffineblokken waarin zones met een hoog percentage tumorweefsel aanwezig zijn zorgen voor de meest betrouwbare resultaten. Wanneer er keuze is uit verschillende monsters, dienen bijgevolg paraffineblokken met dense zones tumorweefsel verzonden te worden.

Om genomisch DNA van goede kwaliteit te bekomen is het eveneens aangewezen:

• het weefsel te fixeren in 10% gebufferde formol (4% formaldehyde, NF4)
• de tijd tot fixatie van het monster zoveel mogelijk te beperken
• de fixatieduur van het monster tussen de 6u en 72u te houden

Toepassingsgebied: Methylatie van DNA gebeurt op cytosine residu’s en dit voornamelijk in kleine DNA regio’s ( < 500bp) die een verrijking van CpG dinucleotides bevatten. Deze regio’s bevatten een GC concentratie van > 55% en worden CpG eilanden genoemd. De promotor regio van het MLH1 gen bevat een CpG rijk gebied, de zogenaamde C-regio. Hypermethylatie van deze regio inhibeert de transcriptie/expressie van het MLH1 eiwit.

Tumoren met afwezigheid van de IHC kernkleuring voor MLH1 tonen vaak (80%) een somatische hypermethylering van de MLH1 promoter. Bij deze gevallen ligt er dan in principe geen erfelijke maar wel een somatische oorzaak ten grondslag aan de aanwezigheid van MSI. Bij 20% van de tumoren is het verlies van MLH1 expressie echter te wijten aan een erfelijke mutatie. Bij MLH1-deficiëntie in een tumor is het daarom aangewezen om eerst MLH1 promotor methylatie te testen alvorens patiënten te verwijzen voor counseling door een klinisch geneticus.

Literatuurreferenties:

1. Deng G, Chen A, Hong J, Chae HS, Kim YS. Methylation of CpG in a small region of the hMLH1 promoter invariably correlates with the absence of gene expression. Cancer Res. 1999 May 1;59(9):2029-33.

2. Pérez-Carbonell L, Alenda C, Payá A, Castillejo A, Barberá VM, Guillén C, Rojas E, Acame N, Gutiérrez-Aviñó FJ, Castells A, Llor X, Andreu M, Soto JL, Jover R. Methylation analysis of MLH1 improves the selection of patients for genetic testing in Lynch syndrome. J Mol Diagn. 2010 Jul;12(4):498-504. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090212. Epub 2010 May 20.

Analyses die worden uitgevoerd op UZA maar niet betaald worden via RIZIV (KB art.33bis), worden in principe aangerekend aan de patiënt. Voor meer informatie, gelieve u te wenden tot secr.anapat@uza.be

Het Universitair Ziekenhuis Antwerpen pathologische anatomie is geaccrediteerd door BELAC onder certificaatnummer 367-MED voor deze analyse.​